结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用荧光染料SYBR Green渗入法,通过对real-time PCR反应条件进行优化,建立了real-timePCR检测方法,用该方法定量分析新城疫病毒(NDV)F基因在重组鸡痘病毒(rFPV-F-VP0)第1、5、10、15、20代次中的表达整合情况。结果表明,建立的标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。在线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,0.99<相关系数(r2)<1,0.8<扩增效率(E)<1.2,熔解曲线为单一特征峰型。本试验精确定量了外源基因在重组鸡痘病毒中的表达水平,为阐明重组鸡痘病毒的表达机理提供了理论基础。     

论表达自由的界限（下）——从比较法、特别是普通法的视角切入

表达自由是自由社会的人们享有的一项带有普遍性的、根本性的权利,通常表现为宪法或法律规定的权利。鉴于各国政治和法律体制以及文化环境之不同,人们享有该项权利的普遍性和充分性存在很多差别,因此,可从比较法,特别是普通法的角度关注该项根本权利的行使及对其设定的界限和施加的限制,集中展示强加这等界限或限制的法理学说、理据以及方法和途径,并分析提出具有普遍意义的结论。     

论意思表示错误——以与重大误解制度比较的视角

意思表示错误制度,在平衡意思自治、保护信赖利益、维护交易安全方面发挥着重大作用。国外民法对意思表示错误的研究比较深入,但我国《民法通则》并没有采用错误这一概念,而是以重大误解取而代之,且规定粗陋。本文从与重大误解制度比较的视角,以历史发展路径、法理基础、结构效力差异、立法完善构想等四个部分论意思表示错误,以求为我国意思表示制度的构建提出建设性意见。     

论表达自由的界限（上）——从比较法、特别是普通法的视角切入

表达自由是自由社会的人们享有的一项带有普遍性的、根本性的权利,通常表现为宪法或法律规定的权利。鉴于各国政治和法律体制以及文化环境之不同,人们享有该项权利的普遍性和充分性存在很多差别,因此,可从比较法,特别是普通法的角度关注该项根本权利的行使及对其设定的界限和施加的限制,集中展示强加这等界限或限制的法理学说、理据以及方法和途径,并分析提出具有普遍意义的结论。     

MDCK细胞感染犬细小病毒后的差异表达谱分析

通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。     

鸭肝炎病毒VP1和VP3基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

为了构建鸭肝炎病毒VP1和VP3结构蛋白基因的杆状病毒表达载体,以RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒的VP1和VP3基因,克隆至pGEM-T载体。经筛选测序验证后,以BamHⅠ+XhoⅠ双酶切回收VP1和VP3目的片段,与经相同方法处理的杆状病毒转座载体pFastBac1连接,得到重组质粒pFastBac1-VP1和pFastBac1-VP3。将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选,成功获得各自携带VP1和VP3基因的重组穿梭载体,将其命名为rBacmid-VP1、rBacmid-VP3。研究结果为进一步在昆虫细胞中表达VP1或VP3基因,开发研制鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

中华鳖TLR2部分序列的克隆及其组织表达差异分析

为探究中华鳖天然免疫的分子机制,针对TLR2(Toll-like receptor 2)保守区设计兼并引物,从中华鳖脾cDNA中扩增出了740bp的目标序列。测序和序列分析结果表明,该序列包含富含半胱氨酸型C端结构域、跨膜结构域和TIR结构域;与斑马鱼、鸡等脊椎动物相应的TLR2序列相似性为60.5%～74.4%。采用荧光定量PCR检测中华鳖感染嗜水气单胞菌后各组织TLR2mRNA表达的变化,结果显示,感染后第24小时,中华鳖脾和外周血TLR2mRNA相对表达水平升高,其中外周血中的增幅最显著,是对照组的8.57倍;中华鳖外周血经4μg/mL酵母聚糖刺激后,第2小时TLR2mRNA相对表达水平较高。首次获得了中华鳖TLR2部分cDNA序列,并分析了不同刺激物对中华鳖TLR2mRNA转录的影响。     

乡村治理变迁与新乡贤的当代表达

随着我国乡村社会由现代的逐步转型,乡村社会形态在变迁过程中呈现出农业社会、工业社会、现代社会相互叠加的异像,乡村的经济、社会、秩序、道德都进入破碎-重构的通道面临重重困境,作为国家治理重要环节的乡村治理面临重重困境。乡贤文化依附强烈的地缘、血缘、亲缘关系而生而长,内涵着特定场域内的风俗、人情、道德、礼法、情感、习惯及信仰,是我国千百年来乡村治理经验与智慧的宝贵结晶。当代新乡贤因其在治理传统、身份特性、能力资源、行为标尺、品德垂范等方面的“有用性”和“可用性”,为解构乡村治理困境提供了新的思路。